Prática 3: Técnicas de semeaduras
Objetivo: Desenvolver as técnicas básicas de semeadura de material para isolamento de germes
Princípio: Uma população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos em uma amostra, para então classificá-los e caracterizá-los. Os microrganismos na natureza normalmente existem em culturas mistas, com muitas espécies diferentes ocupando o mesmo ambiente. Ao determinar as características de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ou seja, em que todas as células na população são idênticas no sentido de que elas se originaram de uma mesma célula parental. Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários fatores :
- Considerações sobre a origem do material a ser analisado
- A espécie que se imagina estar presente nesta amostra
- As necessidades nutricionais dos organismos
Material: Alça de platina, meio sólido em placa (ágar Mueller-Hinton, ágar sangue, EMB, etc.,), tubos contendo 10ml de meio Mueller-Hinton, pipetas de 1ml, tubos com 4,5ml de salina estéril, alça de Drigalsky, bico de Bunsen, swab estéril, galeria para tubos de ensaio, placas de Petri estéreis, becker de 100ml com álcool, estufa a 37ºC, banho-maria a 100ºC, material biológico (saliva, sec. nasal, sec.ouvido, sec.orofaringe, fezes, urina, etc.)
Métodos:
Técnica de Esgotamento: A mais utilizada para isolamento de germes em meio sólido (ágar sangue, ágar EMB, etc ), onde se utiliza uma alça de platina, previamente flambada e esfriada
- Com a alça de platina, tocar suavemente na amostra.
- Passar a alça sobre o meio de cultura em movimento de zigue-zague sem sobrepor as linha e sem recarregar a Alça[1].
- Incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas
Espalhamento “Pour Plate”: Consiste em fazer uma prévia diluição da amostra e colocar em uma placa de Petri vazia e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para homogeneizar a amostra diluída com o meio de cultura. Técnica:
- Fazer diluição seriada da amostra, ex. 1/10, 1/100 e 1/1000.
- Colocar 1 ml de cada diluição em uma placa de Petri estéril
- Fundir 10 ml de meio sólido e refriar a 65ºC
- Derramar sobre a amostra na placa e aplicar movimentos suaves na placa para misturar a amostra com o meio;
- Esperar o meio solidificar novamente e incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas
Espalhamento Pós Plate: Consiste em espalhar a amostra diluída ou não sobre o meio com auxilio da alça de Drigalsky, para obter colônias isoladas.
Resultados: Observar as colônias isoladas, caracterizadas pela formação de pontos isolados sobre o meio de cultura, após a incubação.
Recomendações Para Semeadura de Material Biológico
Para execução de uma boa semeadura, certas precauções especiais devem ser observadas pelo manipulador, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação no Laboratório:
- Todo processo deve ser feito em ambiente limpo e desinfetado, próximo de uma chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;
- Alça de platina utilizada para semear, deve ser flambada antes e depois da semeadura;
- As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre a tampa
- Regular a entrada de ar do bico de Bunsen, para obter uma chama azul ( zona de esterilidade );
- Os tubos ou recipientes com meios de cultura, estéreis ou com material a ser inoculado, deverão ser abertos ou manipulados, somente na proximidade da chama do bico de Bunsen (zona estéril);
- As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de Bunsen.
- As alças ou agulhas, de platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente antes e depois de qualquer transferência. Elas devem ser flambadas em todo seu comprimento, a partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, até ao rubro, mantendo-as em posição vertical à chama do bico de Bunsen. Nunca iniciar a flambagem pela extremidade livre da alça ou agulha. Deixar esfriar nas proximidades da chama;
- Passar, ligeiramente, dentro da chama do Bico de Bunsen, imediatamente antes e depois da transferência, pipetas graduadas estéreis, pipeta Pasteur, ou alça de Drigalsky;
- Nunca abrir ou deixar aberto verticalmente os tubos ou frascos com culturas, incliná-los a aproximadamente em ângulo de 30º;
- No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal. Flambar também a boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios, imediatamente antes e depois da transferência;
- Nunca depositar a tampa ou tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a bancada ou mesa de trabalho;
- Descartar pipetas usadas em recipientes contendo soluções detergentes ou desinfetantes;
- Tratar de dispor o material de trabalho em posição adequada à fácil manipulação, sem riscos de acidentes ou trocas. Manter os tubos, alças e agulhas sempre na posição vertical, em suportes e estantes apropriadas;
- Identificar adequadamente o material de trabalho.
Conservação das culturas puras
Uma vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, é necessário manter as culturas vivas por um período de tempo com o objetivo de estudá-las. Para armazenar por um período curto, as culturas podem ser mantidas à temperatura de refrigeradores (4 a 10 oC); Para armazenar por um período longo, as culturas são mantidas em nitrogênio líquido (-196 oC) ou em freezers (-70 a -120 oC), ou ainda congeladas, e então desidratadas e fechadas à vácuo em um processo denominado liofilização
Alguns dos mais usados métodos de conservação:
- Transferência periódica para meios novos
- Sob camada de óleo mineral
- Liofilização
- Congelamento
As coleções de culturas são bancos de microrganismos e outras células que estão à disposição de pesquisadores, professores, investigadores de patentes, e todo aquele que necessite estudar um tipo particular de microrganismos - um conjunto de células de referência de uma coleção de cultura padrão. As células são congeladas em cubas de nitrogênio líquido ou liofilizadas para resistir a qualquer variação que possa destruir a identidade da célula original.
QUESTÕES
- O que significa semear um material clinica?
- Qual principio das técnicas de semeadura?
- O que significa repicar uma cultura?
- Como se obtém uma cultura pura.
- Qual importância da cultura pura no diagnóstico de doenças infecciosas?
- Para se identificar uma bactéria é necessário se obter uma cultura pura. Por que uma cultura mista conduz a erros de identificação?
- Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários fatores. Cite-os.
- Por que todo processo de semeadura deve ser feito em ambiente limpo e desinfetado, próximo de uma chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;
- As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre a tampa. O que pode ocorrer com as colônias se as placas forem incubadas com a tampa para cima?
- Comente sobre os seguintes métodos de conservação de bactérias: a) Liofilização, b) Congelamento, c) Transferência periódica para novos meios, d) conservação sob camada de óleo mineral
PRATICA 2: PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
Objetivo: Familiarizar o aluno com o preparo
dos meios de cultura mais usados em microbiologia; Discutir a aplicação de
meios específicos para o cultivo de microrganismos distintos
Princípio: Os microrganismos, para um
crescimento adequado, necessitam de nutrientes (fontes de carbono, nitrogênio,
enxofre, fosfato, etc., ) e condições ambientais favoráveis (pH, pressão
osmótica, temperatura, umidade, etc., ).
Meios
de cultura são associação qualitativa e quantitativa de substâncias que
permitem o cultivo de microrganismos fora do meio natural. Em condições
naturais, nos diversos “habitats”, os microrganismos ocorrem em populações
mistas. Os meios de cultura permitem isolar os microrganismos para estudo e
pesquisa.
Material: Peptona, extrato de carne,
ágar-agar, ágar Mueller-Hinton, Caldo
BHI, sangue de carneiro desfibrinado, tubos contendo 10ml de ágar-base estéril
PH-metron, placas de Petri estéreis, pipetas de 1ml estéril, balança, provetas.
Equipamentos: Autoclave, cronômetro, Banho-Maria a
55ºC
Método - Formulações
Caldo Simples
Peptona.....................5,0g
Extrato de
carne ......3,0g
Água destilada .... 1000ml
|
Pesar os ingredientes, dissolver em
água destildada e acertar o pH para
7,3. Distribuir em 2ml/tubo. Autoclavar 120°C por 15'. Manter em
geladeira.
|
Ágar Simples
Ágar....................
15,0g
Peptona.................
5,0g
Extrato de carne
....3,0g
Água destilada ...1000ml
|
Pesar os ingredientes e dissolver a
quente. Acertar o pH para 7,3. Autoclavar 120°C por 15'. Distribuir em placas. Manter em
geladeira.
|
Ágar
Sangue: Adicionar
sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e resfriado a 55ºC,
na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar nutriente adicionar 0,5ml
do sangue. Homogeneizar e distribuir em placas.
Ágar Chocolate: Adicionar
sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e resfriado a 70ºC,
na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar nutriente adicionar 0,5ml
do sangue. Homogeneizar e distribuir em placas.
Ágar Mueller Hinton
Composição
(g/litro)
Infuso de carne
.......300g
Casaminoácido
.......17,5g
Amido......................1,5g
Ágar
.........................17g
pH
final 7,3
|
MODO DE PREPARAÇÃO
Suspender
38,0g em 1000ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição para
dissolver completamente. Esterilizar em autoclave durante 10 min., a 15 Atm pressão (121ºC), esfriar a 50ºC e
distribuir em placas de Petri.
|
Caldo BHI (Brain Heart Infusion)
Composição
(g/litro)
Infuso
de cérebro de carneiro...200g
Infuso
de coração bovino ...... 250g
Peptona
proteosa, Difco ......... 10g
Dextrose
................................... 2g
Cloreto
de sódio ...................... 5g
Fosfato
disódico .................... 2,5g
|
Modo
de preparação
Dissolver 37 gramas em um litro
de água destilada ou deionizada. Agitar até completa dissolução. Esterilizar
em autoclave durante 15 minutos a 15 atm.
pH
final 7,4
|
COMENTÁRIOS
Desde
o inicio, os microbiologistas aprenderam que podiam cultivar uma grande
variedade de bactérias em “caldos”, obtidos pela cocção de tecidos animais ou
vegetais. Em 1923, Mueller,
tentando definir esta vaga necessidade, em termos de compostos específicos,
descobriu o então desconhecido aminoácido, metionina. A nutrição bacteriana
tornou-se campo dinâmico durante os anos subsequentes; porém com o
reconhecimento da unidade bioquímica, os vários esquemas nutritivos revelaram
ser simplesmente pequenas variações de um tema central e o estudo da nutrição
bacteriana perdeu muito de seu interesse teórico. Apesar disso, este campo
detém sua importância prática e ainda apresenta desafios; por exemplos, o
bacilo da lepra, o treponema da sífilis e riquétsias não podem ser cultivados
em meios artificiais.
Inicialmente,
o único método existente para contagem de bactérias ou para o isolamento de
culturas puras (clones), era a diluição até a extinção, isto é, até a perda da
infectividade. Um progresso importante foi a introdução dos meios sólidos por
Koch. Os materiais usados inicialmente eram pouco satisfatórios: a superfície
da batata cortada podia permitir um crescimento confluente, enquanto que a
gelatina permanecia sólida apenas em temperaturas relativamente baixas, sendo
liquefeita por muitos microrganismos. Assim sendo, Frau Hesse, esposa de um
médico e bacteriologista amador alemão, introduziu o ágar, um produto japonês
que ela empregava para engrossar as sopas.
O
ágar (do malaio “agar-ágar”) é um polissacarídeo obtido de certas algas
marinhas (várias algas vermelhas). Constitui-se primariamente de galactose, com
um radical sulfato para cada 10 ou 50 resíduos. O ágar mostrou-se ideal para
formar meios sólidos. Não é tóxico para a bactéria, e muito poucas conseguem
atacá-lo. Em concentrações de 1,5
a 2,0% apresentam uma superfície úmida para permitir
crescimento, mas seca o bastante para manter separadas as colônias
(Excepcionalmente, certos microrganismos móveis, como Proteus, exigem ágar a 5% para impedir a formação do véu.
Após
a fusão entre 80 e 100ºC, as soluções de ágar permanecem líquidas até 45-50ºC,
temperatura que muitas bactérias toleram por alguns instantes; após a
solidificação em temperatura ambiente, permanecem sólidas até muito acima de
37ºC. A estrutura fibrosa de um gel é suficientemente compacta para impedir a
movimentação de bactérias no seu interior, mas bastante aberta para permitir a
difusão, até mesmo de nutrientes macromoleculares.
QUESTÕES
- As
condições necessárias para preparar os meios de cultura foram observadas?
Qual a influencia dessas condições para a conclusão dos trabalhos?
- Os
procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as
alterações ou adaptações realizadas
- Relacione
os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais
outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento
pela falta ou substituição do material?
- O que são
macronutrientes ? Cite os principais exemplos
- Os meios de cultivo e a idade da
colônia exercem alguma influência na morfologia de células em coloração
simples?
- Alguns microrganismos, como Micobacterium leprae, ainda não se
conseguiu cultivar em meios de cultura. Quais as possíveis dificuldades e
qual a importância desta técnica?
- Quais
as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
- Descreva
os procedimentos para realização do teste de esterilidade dos meios de
cultura
- Os
procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os
possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor
sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
- Elabore 10 questões a respeito da
prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas
PRÁTICA 1: COLORAÇÃO DE GRAM
Objetivo: Observar formas, disposição e comportamento
tintorial das bactérias. Distinguir bactérias Gram-positivas das Gram-negativas
Princípio: O método de Gram permite classificar as bactérias em dois grandes grupos: as que
retêm Violeta de genciana ( Gram-positiva ) e as que não retém o violeta
genciana (Gram-negativa). Além do mais, é útil para determinar a forma ( cocos
e bacilos ), e o arranjo das células após a divisão celular ( em forma de
cacho, cadeias, sarcina etc., ). As células
bacterianas são caracterizadas morfologicamente:
·
Comportamento
tintorial: Gram-positiva ou Gram-negativa
·
Forma: cocos
(esféricos), bacilos (cilindricos) e espirilos (espiralados)
·
Arranjo:
Disposição das células entre si. Os cocos podem estar isolados, aos
pares(diplococos), agrupados em cachos (estafilococos), em cadeia
(estreptococos). Os bacilos e espirilos se apresentam em geral como células
isoladas porém, ocasionalmente, pode-se
observar bacilos aos
pares (diplobacilos) ou em cadeia ( estreptobacilos ).
Quanto
ao tamanho, as células bacterianas são sempre de dimensões microscópicas, o
diâmetro da maioria delas varia de 0,2 a 1,5 mm e comprimento de 1 a 6 mm.
Material: Reagentes de Gram: sol. cristal-violeta 2%; sol.
aquosa de iodo (Lugol); mistura álcool-acetona; sol. alcoólica de safranina,
Lâminas: Suporte para lâminas; alça de platina; Bico de Bunsen; Microscópio; Óleo de Imersão
Método:
·
Cobrir a área do
esfregaço com a solução de
cristal-violeta por cerca de 1min.;
·
Lavar com água
corrente e escorrer o excesso de água;
·
Cobrir a área do
esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
·
Descorar a lâmina
com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
·
Cobrir o
esfregaço com a solução de safranina1 por cerca de 30 segundos;
·
Lavar com água
corrente;
·
Deixar secar ao
ar .
REAGENTES PARA COLORAÇÃO DE GRAM
Cristal Violeta
Solução A
Cristal-violeta.......... 2g
Álcool etílico
............ 20 ml
Solução B
Oxalato de amônio ......
0,8g
Água destilada ............ 80
ml
MISTURA A + B
|
Lugol
Iodo
...........................1g
Iodeto de
potássio ...... 2g
água
destilada ...... 300ml
|
Contracorante
Solução estoque:
Safranina 2,5 g / 100ml
Solução uso: Diluir sol.
estoque 1/10
|
|
Interpretação:
As bactérias
Gram-positivas retém o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta,
enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto,
coradas pela safranina e se apresentam róseas.
Questões
1. A coloração de Gram possibilita caracterizar as
bactérias quanto ao comportamento tintorial (Gram-positiva e Gram-negativa),
morfologia (cocos, bacilos, espirilos) e arranjo (em cacho, em cadeias, aos
pares). Qual o significado destas informações para a medicina?
2. A coloração de Gram exerce alguma importância em
diagnósticos clínicos de bactérias isoladas de infecções humanas e animais?
Citar pelo menos um exemplo.
3. Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a
aplicação dos corantes que integram a metodologia. Comentar os resultados
possíveis de serem obtidos com as inversões da sequência referida no método.
4. Sabe-se que se a parede celular é o sítio preferido
pela fixação da reação de Gram. Fazer um esquema mostrando esta associação,
para o caso típico de uma bactéria Gram-positiva.
5. Sendo o Gram um método de coloração diferencial, como
esta reação pode ser empregada para a verificação do estado de pureza de uma
determinada cultura?
6. Comente o efeito da penicilina sobre a parede celular
bacteriana, correlacionando-o com a reação tintorial de Gram.
7. Comente a frase: “Uma bactéria Gram-negativa pode
tornar-se Gram-positiva, dependendo do tempo de incubação da cultura, mas o inverso
não é verdadeiro”.
8.
Os procedimentos realizados estão de acordo com o
protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
9.
Relacione os matérias listados neste protocolo que
não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma
falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
10.
Quais as dificuldades encontradas na realização
dessa prática?
11.
Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com
rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o
professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
12.
Elabore
10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento
das suas dúvidas
